Deglikolize kolisin M ve K formlarının bitkide ın vıvoüretimi, saflaştırılması, karakterizasyonu ve doğal gıda katkı maddesi olarak kullanım olanakları
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Akdeniz Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Fen Bilimleri Enstitüsü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2023
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: MERVE ILGIN BÜYÜKSINDIR
Danışman: Tarlan Mammedov
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Günümüzde gıdalarda yaygın olarak bulunan bakteriyel patojenlere karşı artan direnç, küresel halk sağlığı ve gıda güvenliği için kritik bir tehdit oluşturmaktadır. Ayrıca tüketicilerin kimyasal katkı maddesi içermeyen doğal gıdalara olan talebinin artması bilim insanlarını alternatif gıda koruyucuları bulmaya yöneltmiştir. Kolisinler, belirli Escherichia coli (E. coli) suşları tarafından üretilen, konakçı olmayan E. coli suşlarını öldüren ve diğer bakteri suşları ile rekabeti azaltmak için çevreye salınan antimikrobiyal proteinlerdir. Kolisin-M, dış hücre zarını tahrip ederek yakından ilişkili diğer bakteri suşlarına etki eden bu grubun bir üyesidir ve FDA tarafından güvenli (GRAS) olarak kabul edilmiştir, bu nedenle güçlü bir antimikrobiyal madde olarak büyük bir potansiyele sahiptir. Kolisin M (CM), geçici ekspresyon sistemi kullanılarak bitkilerde rekombinant olarak eksprese edilmiş ve antimikrobiyal aktivitesi gösterilmiştir. Bakteriyel protein olarak kolisin M, doğal konakçılarda glikozile edilmez ve bu nedenle bitkiler dahil herhangi bir ökaryotik sistemde anormal şekilde glikozile edilir. Bakteriyel Endo H deglikozilasyon enzimi ile ortak ifade yoluyla hedef proteinleri glikozile edilmemiş bitkiler de dahil olmak üzere ökaryotik sistemde proteinler üretmek için sağlam bir teknoloji geliştirilmiştir. Bu teknoloji, şarbona, sıtmaya, Covid-19'a, kuduza karşı aşı üretmek ve bazı terapötikler için başarıyla uygulanmıştır. Bu çalışmanın amacı, Nicotiana benthamiana (N. benthamiana)'da N-glikozile edilmemiş, doğal benzeri formda Endo H deglikozilasyon teknolojisi kullanılarak rekombinant Kolisin-M üretmektir. Bu çalışmada, enzimatik Endo H deglikozilasyon teknolojisi kullanılarak, N. benthamiana bitkisinde hem glikozile edilmiş (gCM) hem de-glikozile edilmiş (dCM) formda rekombinant kolisin M ürettik ve bunların antimikrobiyal aktivitesi ve stabilitesi karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Kolektif bulgularımız, dCM'nin glikozile edilmiş formuyla karşılaştırıldığında stabilitesinin ve aktivitesinin daha yüksek olduğunu gösterdi. Karşılaştırma için Kolisin K (CK), N. benthamiana'da hem Endo H ile hem de Endo H olmadan ifade yoluyla üretildi. CK'nin birkaç potansiyel N-glikozile edilmiş bölgesi olmasına rağmen, sonuçlarımız CK'nin N. benthamiana bitkisinde eksprese edildiğinde glikozile olmadığını doğruladı. Rekombinant bitki tarafından üretilen proteinler (hem Endo H ile ortak ifade ile hem de olmadan), Ni-kolon afinite kromatografisi kullanılarak kısmen saflaştırıldı ve stabilite ve aktivite açısından karakterize ettiğimiz kısmi saflaştırılmış CK proteinlerinde Endo H ile ifade edilen veya edilmeyen CK'ler arasında anlamlı bir fark gözlenmedi. Tez çalışmasından elde edilen sonuçlar; bitkide üretimi gerçekleştirilen gCM ve dCM proteinlerinin SDS-PAGE ve Western-Blot analizine göre, moleküler kütleleri sırasıyla ~29 ve 26 kDa olarak bulunmuştur. Hem gCM hem de dCM'nin stabilite analizi, +4 °C, +25 °C ve +37 °C'de uzun süre (sırasıyla 4 ay, 12 gün ve 6 gün) incelenmiş ve dCM, glikozile edilmiş muadilleriyle karşılaştırmada tüm sıcaklıklarda üstün stabilite göstermiştir. Bitkide üretilen CM proteinlerinin antimikrobiyal aktivite testleri, seçilen E. coli DH5α ve ATCC 25322, Salmonella ATCC 17028 ve Staphylococcus aureus (S. aureus) ATCC25923 suşları üzerinde gerçekleştirilmiştir. Tüm aktivite testlerinde dCM proteini, glikozile edilmiş muadilinden daha aktif sonuçlar vermiştir. Sırasıyla aralarında, 3,8, 1,7, 4,4 ve 2,4 katlık bir oran çıkmıştır. Ek olarak, dCM'nin ekspresyon seviyesi ve saflaştırma verimi, glikozile edilmiş muadili ile karşılaştırıldığında 2 kat daha yüksek çıkmıştır. Sonuç olarak, sonuçlarımız, deglikozile edilmiş Endo H teknolojisinin, glikozile edilmemiş diğer kolisinleri, doğal benzeri formlarında üretmek için kullanılabileceğini göstermektedir; bu, bu kolisinlerin bir gıda katkı maddesi olarak ticarileşme potansiyelini artırmak için önemli olacaktır