Farklı formlardaki nanohidroksiapatitlerin sitotoksik ve genotoksik etkilerinin araştırılması

MERVE GÜNEŞ

Farklı formlardaki nanohidroksiapatitlerin sitotoksik ve genotoksik etkilerinin araştırılması

Tezin Türü: Doktora

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Akdeniz Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Fen Bilimleri Enstitüsü, Türkiye

Tezin Onay Tarihi: 2022

Tezin Dili: Türkçe

Öğrenci: MERVE GÜNEŞ

Danışman: Bülent Kaya

Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu

Özet:

Biyomalzemeler, ortopedik uygulamalarda, yüz ve çene cerrahisinde, yapay kalp parçalarında, metal parçalarda ve vücuda yerleştirilebilir cihazlarda kullanılmaktadır. Bu malzemeler organizmaya uyumlu olması, alerjik olmaması, fiziksel ve kimyasal etkenlere karşı dayanıklı olması sebebiyle tıp alanında yaygın olarak kullanılmaktadır. Hidroksiapatit (HA) doku ile uyumluluk gösteren biyoaktif kalsiyum fosfat seramiklerindendir. Bu çalışmada nano boyutlu HA (nHA)'ların küre ve çubuk formlarının etkileri in vivo ortamda Drosophila melanogaster'da ve in vitro ortamda iki farklı hücrelerinde (insan embriyonik böbrek epitel (293T) ve insan vasküler endotel (HUVEC) hücre hatları) araştırılmıştır. in vivo çalışmalarda Drosophila Kanat Somatik Mutasyon ve Rekombinasyon Testi (SMART) ve Tek Hücre Jel Elektroforezi (KOMET) yöntemleri ile nHA'ların potansiyel genotoksisitesi araştırılmıştır. Hücre ölüm yolaklarındaki aktivasyonun incelenmesi amacıyla Drosophila hemositlerinde kaspaz aktiviteleri değerlendirilmiştir. Drosophila'da gen ifadelerinin araştırılması amacıyla Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT2-PCR) yöntemi ile DNA tamirinde görevli 36 adet genin ifadeleri araştırılmıştır. in vitro çalışmalar kapsamında 293T ve HUVEC hücre hatlarında WST-1 hücre canlılık testi ve tripan mavisi testi ile sitotoksisite ve KOMET ile genotoksisite potansiyeli değerlendirilmiştir. Elde edilen sonuçlara göre nHA küre ve çubuk formlarının potansiyel genotoksik etkileri D. melanogaster somatik hücrelerle ile yapılan SMART testinde küre formda küçük tek tip, toplam mwh klonlar ve toplam klonlar bakımından 50, 100 ve 200 ppm'lik konsantrasyonlarda genotoksisite tespit edilmiştir. Çubuk formlu nHA uygulamalarında çalışılan hiçbir dozda genotoksik etki gözlenmemiştir. Drosophila hemositleri ile yapılan KOMET testinde 100 ppm konsantrasyonundaki küre ve çubuk formlu nHA'lar Drosophila hemositlerinde kuyruk yoğunluğu bakımından genotoksisiteye sebep olmuştur. Yapılan kaspaz aktiviteleri çalışmalarında küre formda 200 ppm'lik konsantrasyonun kaspaz-3/7, kaspaz-8 ve kaspaz-9 aktivitesini arttırdığı belirlenmiştir. Çubuk formlu nHA 25 ve 50 ppm'lik dozlarda içsel yolak sinyal kaskadlarını (kaspaz9 ve kapaz3/7) aktive ederken, yüksek konsantrasyonlarda dışsal apoptotik yolağı (kaspaz8) aktive ettiği belirlenmiştir. Gen aktivasyonun incelendiği RT2-PCR analizinde küre formda 25 ppm'lik uygulamada Mlh1 ve Brca2 genlerinde artış gözlenirken spel1, Rad51C, dap, MCPH1, Rad51D, Rad1, Pms2, mu2, Sir2 genlerinde azalma meydana gelmiştir. 200 ppm'lik konsantrasyonda ise Mlh1 geninin ifadesinde artış gözlenirken Fen1, Rad9, Fancd2, Rad51C, Hus1-like, dap, DNA-ligl, MCPH1, Rad51D, Ercc1, Rev1, Pms2, tefu, RpLP2 genlerinin ifadesinde ise azalma meydana gelmiştir. Çubuk formda 25 ppm'lik konsantrasyonda azalma, Mlh1 ve Brca2 gen ifadelerinde artış gözlenmiştir. Bunun yanında CG9601/PNKP, Rev1, Dap, mu2, RpLP2, Pms2, spel1, Sir2, Rad51C, PCNA, stg, Rad51D, Fen1, MCPH1 genlerinde azalma meydana gelmiştir. 200 ppm'lik konsantrasyonda çalışan genlerin ifadelerinde artış meydana gelmemiş olup Xpac, spel1, Fen1, Rad9, Tbp, Cdk7, DNApol-eta, Fancd2, XRCC1, Rad51C, Hus1-like, Ogg1, dap, DNA-ligl, CG9601, mei-41, MCPH1, put, Rad51D, Rev1, Rad17, Rad1, Pms2, mu2, tefu, RpL32, Sir2, RpLP2, stg, SdhA genlerinde azalma tespit edilmiştir. Tez çalışması kapsamında 293T hücrelerinde WST-1 testi ile yapılan değerlendirmede hem küre hem de çubuk formlu nHA uygulamalarında 24, 48 ve 72 saatlik inkübasyon sürelerinde doza bağlı olarak hücre canlılığının arttığı gözlenmiştir. Tripan mavisi ile yapılan testte küre formda doza bağlı olarak azalan sitotoksik etki gözlenmiştir. Çubuk formda ise sitotoksik etki saptanmamıştır. HUVEC hücre hattında WST-1 testinde hücre canlılığının hem küre hem de çubuk formda doza bağlı olarak arttığı gözlenmiştir. Tripan mavisi ile yapılan değerlendirmede sadece 24 saatlik inkübasyonda küre formda 1000, 800, ve 600 ppm'lik konsantrasyonlarda sitotoksik etki gözlenmiştir. Çubuk formda ise 48 ve 72 saatlik inkübasyon sürelerinde sitotoksik etki gözlenmiştir. in vitro komet sonuçlarına göre küre formlu nHA 293T hücrelerinde kuyruk yoğunluğu parametresinde genotoksik etkinin her üç inkübasyon süresinde de düşük dozlarda daha fazla olduğu gözlenmiştir. Çubuk formlu nHA'nın 293T hücrelerindeki genotoksik etkileri kuyruk yoğunluğunda 24 saatlik inkübasyon süresinde 200 ppm haricindeki dozlarda genotoksik etki gözlenirken 48 saatlik inkübasyon süresinde 400 ppm'lik dozda 72 saatlik inkübasyon süresinde 200 ve 400 ppm'de DNA hasarı gözlenmiştir. Küre formlu nHA'nın HUVEC hücrelerindeki genotoksik etkisi kuyruk yoğunluğu parametresinde 24 saatlik inkübasyon süresinde 200 ppm, 48 saatlik inkübasyon süresinde 800 ppm ve 72 saatlik inkübasyon süresinde 1000 ppm haricindeki tüm dozlarda DNA hasarı gözlenmiştir. Çubuk formlu nHA HUVEC hücrelerinde kuyruk yoğunluğu parametresinde 24 saatlik inkübasyon süresinde 200 ve 400 ppm, 48 saatlik inkübasyon süresinde 400 ve 800 ppm dozlarında genotoksik etki gözlenmiştir. Bunun yanında 72 saatlik inkübasyon süresinde çalışan dozların hiçbirinde DNA hasarı gözlenmemiştir. Çalışmadan elde edilen sonuçlara göre çubuk formun hem D. melanogaster'da yapılan hem de 293T ve HUVEC hücre hatları ile gerçekleştirilen deneylerde küre forma göre daha az toksik etkiye neden olduğu gözlenmiştir. Küre form hem morfolojik yapısı hem de boyutsal olarak çubuk forma göre daha küçük olması sebebiyle hücrelerdeki toksisite yanıtlarını indüklemiş olabileceği düşünülmektedir.