Amaç: Oksisteroller, kolesterolün çok sayıda kimyasal tepkime yoluyla oksidasyona uğramasıyla oluşan ve birçok fizyolojik süreçte ve çeşitli dejeneratif ve metabolik hastalıklarda, lipid metabolizması bozukluklarında önemli rol oynayan türevlerdir. Bu çalışmada, önemli oksisteroller arasında yer alan kolestan-3β,5α,6β-triol ve 7 -ketokolesterol ölçümünde çeşitli ekstraksiyon ve türevlendirme basamakları denenerek, sıvı kromatografisi-ardışık kütle spektrometrik yöntemin analitik validasyonunun yapılması amaçlanmıştır. Materyal ve Metod: Optimizasyon çalışmaları, çoklu reaksiyon izlem modunda, pozitif elektrosprey iyonizasyon ile sıvı kromatografisi-ardışık kütle spektrofotometresi cihazında yapılmıştır. İnsan plazma örneklerinde dimetilglisin türevlendirmesiyle kolestan-3β,5α,6β-triol ve 7 -ketokolesterol çoklu ölçümünün analitik validasyonu değerlendirilmiştir. Bu amaçla; linearite, doğruluk analizi, tekrarlanabilirlik, saptama ve ölçüm limitleri, geri kazanım, carry-over analizi gibi parametreler çalışılarak sonuçlar istatistiksel olarak değerlendirilmiştir. Bulgular: Analiz süresi her iki parametre için 10 dakika olarak belirlendi (kolestan-3β,5α,6β-triol: 3.1 dakika, 7-ketokolesterol: 7.26 dakika). Oluşturulan kalibrasyon eğrilerinde; kolestan-3β,5α,6β-triol için r2:0.999, 7-ketokolesterol için r2:0,994 olarak bulundu. Üç farklı kalite kontrol örneğinde yapılan çalışma içi ve çalışma arası kesinlik sonuçlarında varyasyon katsayısı %15’in altında, doğruluk % 93.76- 102.25 arasında bulundu. Sağlıklı kontrollerde (n=25) plazma kolestan-3β,5α,6β-triol düzeyleri ortalama 25.61±9.2 ng/mL (min: 15.7, maks: 38.61) olarak bulundu. 7-ketokolesterol ölçümlerinde kalibrasyon ve kalite kontrol sonuçları geçerli olmasına rağmen kontrol plazma örneklerinde tekrarlanabilir sonuçlar alınamadı. Sonuç: Bu çalışma ile, Niemann Pick-C hastalığı ve Alzheimer hastalığı, Multiple Skleroz, spastik parapleji gibi bazı nörodejeneratif bozuklukların tanı ve/veya izlemi için hızlı, duyarlı ve spesifik bir oksisterol analitik yöntemi denenmiş ve metod validasyonu yapılarak klinik laboratuvarda kullanıma hazır hale getirilmiştir.
Aim: Oxysterols are derivatives of cholesterol which are formed by oxidation through numerous chemical reactions and play an important role in many physiological processes and in various degenerative and metabolic diseases, lipid metabolism disorders. In this study, analytical validation of liquid chromatography-tandem mass spectrometric method was evaluated by using various extraction and derivation steps in the measurement of Cholestan-3β,5α,6β-triol and 7-ketocholesterol which are important oxysterols. Material and Methods: Optimization studies were performed in liquid chromatography-tandem mass spectrometry analyser with positive electrospray ionization in multiple-reaction monitoring mode. The analytical validation of cholestan-3β,5α,6β-triol and 7-ketocholesterol multiplex measurements with dimethylglycine derivatization was evaluated in human plasma samples. For this purpose, linearity, accuracy, repeatability, detection and quantitation limits, recovery and carry-over analysis were studied, and the results were evaluated statistically. Results: The time of the analysis was 10 minutes for both parameters (cholestan-3β,5α,6β-triol: 3.1 minutes, 7-ketocholesterol: 7.26 minutes). The r2 value of the calibration curves for cholestan-3β,5α,6β-triol was 0.999, for 7-ketocholesterol was 0.994. The intra- and inter-assay variation coefficients assessed at three concentrations were below 15%. The assay accuracies of analytes ranged from 93.76 - 102.25 %. Plasma Cholestan-3β,5α,6β-triol levels were determined in a control group of 25 individuals (min: 15.7, max: 38.61; mean±SD: 25.61±9.2 ng/mL). Although valid results were obtained in calibration and quality control samples for 7-ketocholesterol, reproducible and reliable results were not obtained for plasma samples of healthy controls. Conclusion: A rapid, sensitive and specific oxysterol analytical method has been tried and made ready for implementation in clinical laboratory by method validation for the diagnosis and/or monitoring of Niemann Pick-C disease and some neurodegenerative disorders including Alzheimer's disease, Multiple Sclerosis and spastic paraplegias in this study.
